骨髓间充质干细胞移植大鼠梗死心肌后的存活状况

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.41.012

摘要/Abstract

摘要：

背景：初步研究结果证实骨髓间充质干细胞治疗急性心肌梗死安全、有效，但是其确切的治疗机制尚不清楚。有关移植后干细胞的存活状况及发挥作用时机的研究较少。

目的：观察大鼠骨髓间充质干细胞移植梗死心肌后的存活状况。

方法：密度梯度离心法培养骨髓间充质干细胞。制作大鼠心肌梗死模型80只，于心肌梗死后14 d，在心肌梗死周边区分4个点用微量注射器移植骨髓间充质干细胞，取移植干细胞后仍存活良好的70只大鼠，分别于移植后第3，5，7，10，14，20，28天检测骨髓间充质干细胞的存活情况。

结果与结论：移植后第3，5，7，10，14，20，28天免疫组化染色高倍视野(×400)内Brdu标记阳性骨髓间充质干细胞数分别为(36±12)，(33±13)，(28±9)，(15±5)，(5±3)，0，0个。移植后骨髓间充质干细胞数整体呈下降趋势，骨髓间充质干细胞数与移植天数呈负相关(r=-0.47，P < 0.01)，其中移植1周后下降明显，至第20天已无存活骨髓间充质干细胞。结果可见骨髓间充质干细胞移植大鼠梗死心肌后不能长期存活且不会转化为心肌组织。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

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关键词: 干细胞, 移植, 急性心肌梗死, 骨髓间充质干细胞, 心肌梗死模型, 细胞移植

Abstract:

BACKGROUND: The preliminary findings confirm that bone marrow mesenchymal stem cell transplantation is safe and effective in the treatment of acute myocardial infarction, but its exact mechanism is unclear. There are few studies addressing the survival status of transplanted stem cells and its acting timing.

OBJECTIVE: To study the survival of rat bone marrow mesenchymal stem cells transplanted into the infracted myocardium.

METHODS: Bone marrow mesenchymal stem cells were cultured using density gradient centrifugation. Eighty rat models of myocardial infarction were prepared. Bone marrow mesenchymal stem cells were injected via a microsyringe at four sites around the infarcted region at 14 days after modeling. Then, 70 rats with living cells were selected for detecting the survival of bone marrow mesenchymal stem cells at days 3, 5, 7, 10, 20, 28 after transplantation.

RESULTS AND CONCLUSION: Under ×400 visual field, the number of Brdu-positive bone marrow mesenchymal stem cells was (36±12) at 3 days posttranplantation, (33±13) at 5 days, (28±9) at 7 days, (15±5) at 10 days, (5±3) at 14 days, 0 at 20 days, and 0 at 28 days, showing a overall downward trend after transplantation. The number of bone marrow mesenchymal stem cells was negatively correlated with transplant days (P < 0.01, r=-0.47). The number of cells decreased most significantly within 1 week after transplantation, and then decreased to 0 at 20 days. These findings indicate that transplanted bone marrow mesenchymal stem cells in the myocardium cannot survive for a long term and also cannot be transformed into myocardial tissue.

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Key words: bone marrow, mesenchymal stem cell transplantation, myocardial infarction, models, animal

中图分类号:

R394.2

林楚伟，周胜华，戴海鹰，邓平，黄红光，尹芝兰，关贤颂. 骨髓间充质干细胞移植大鼠梗死心肌后的存活状况[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(41): 6628-6632.

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图/表（结果） 1

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引言

材料方法

设计：细胞移植动物实验。

时间及地点：实验于2012年1至12月在长沙市中心医院中心实验室完成。

材料：

实验动物：清洁级2月龄近交系雄性SD大鼠150只，体质量180-200 g，由中南大学湘雅二医院实验动物中心提供，实验动物许可证号SYXK(湘)2004-082。用于骨髓间充质干细胞培养20只，用于模型制作130只。

实验方法：

骨髓间充质干细胞培养：采用密度梯度离心法对骨髓间充质干细胞体外分离和培养。取2月龄雄性SD大鼠，体质量约为200 g，处死后无菌条件下取出股骨和胫骨，剪去股骨及胫骨的骨骺端，用装有L-DMEM培养液的注射器冲洗骨髓腔，取冲出的细胞悬液约5 mL，小心加入预先加有5 mL淋巴细胞分离液的离心管中，以2 000 r/min速度离心20 min后，取中间液面乳白色单个细胞核层，PBS洗2次后，用含有体积分数为10%胎牛血清的DMEM培基打散，以3×10⁵接种于25 cm²培养瓶。置37 ℃，体积分数为5%CO₂和饱和湿度培养箱培养。48 h后换液，以后每3-5 d换液1次。2周后，细胞基本长满单层，用1 mL 0.25%胰蛋白酶(含0.02%EDTA)消化3-5 min，待细胞变圆后加入体积分数为10%胎牛血清的L-DMEM培养液终止消化，并吹打培养瓶底，按1∶2传代培养，连续培养至第3代。

骨髓间充质干细胞的鉴定：对第3代骨髓间充质干细胞进行抗CD29-FITC、CD45-FITC单克隆抗体及其同型行流式细胞仪检测，EXPO32.V1.2软件分析。收获细胞，移植前72 h行Brdu标记，取部分标记好的细胞行Brdu细胞免疫化学染色鉴定其标记情况。移植细胞锥虫蓝染色检测活细胞率，MTT法检测细胞活力。

大鼠心肌梗死模型制作：开胸法结扎前降支制作心肌梗死模型。参照文献[10]方法略作改进，电子秤称量大鼠体质量，腹腔注射相应剂量的戊巴比妥钠(2%，2 mL/kg)，麻醉完全后固定大鼠仰卧于手术台上；连接好心电监护电极(四肢)，手术前、中、后全程监测心电活动；行气管插管，小动物呼吸机辅助呼吸，开胸暴露心脏后，确定缝扎位置(肺动脉圆锥与左心耳交界处下方2 mm)，5-0(13 mm针)prolene线缝扎左前降支(肉眼不可见)，出针，打结(外科结)；心电监护有ST段抬高(图1)并出现心脏前壁由红润变灰白表示造模成功；记录并观察心电活动；20 min无异常心电活动及胸腔出血后关胸，Prolene线一针缝合气管切口，碘伏消毒术野，对合肌肉及皮下，缝合颈部切口；松开大鼠，放回鼠笼。术后3 d内每天腹腔注射40×10⁴ U青霉素预防感染。随机抽取5只存活大鼠于术后14 d送检病理验证是否有心肌梗死发生(图2)。

骨髓间充质干细胞移植：选取80只大鼠急性心肌梗死模型，2周后再次开胸进行细胞移植，麻醉及开胸过程同上。选取心肌梗死周边，以梗死中心及肺动脉圆锥为参照，在8点到12点钟区域分4个注射点，用微量注射器吸取预先备置的用Brdu标记的骨髓间充质干细胞悬液进行移植，每个注射点注射细胞数量为2×10⁷/50闪。详细记录每只大鼠移植区域，并以数码相机记录移植时进针部位，以便确定日后取材区域(图3)。

心肌组织中Brdu标记检测：继续饲养80只干细胞移植后大鼠，选取70只存活良好的大鼠(入选标准：正常活动、进食、无伤口化脓、毛发亮泽)，分别于移植后第3，5，7，10，14，20，28天开胸取出大鼠心脏标本(每个时间点10只)，对移植部位心肌(每只大鼠移植部位均已用数码相机记录)进行Brdu免疫组织化学染色，每只大鼠制作切片5张。记录每组大鼠每张切片中高倍视野(×400)内Brdu标记阳性细胞数。

主要观察指标：Brdu标记阳性细胞数。

统计学分析：数据处理采用SPSS 13.0统计软件。细胞数与天数之间的关系用双变量相关分析。

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讨论

Brdu标记基本原理：细胞增殖周期包括G₁、S、G₂、M 4个时期，其中S期是DNA合成期，细胞内DNA进行半保留复制，各种构成DNA的原料掺入到DNA中。Brdu作为一种胸腺嘧啶核苷的类似物(其化学结构特点是胸腺嘧啶的碱基嘧啶环上与5位C原子连接的甲基被溴代替)，像胸腺嘧啶核苷一样可掺入到细胞合成的DNA中^[11-14]。当细胞处于DNA合成期而同时又有Brdu存在时，就会有Brdu掺入新合成的DNA中，只要细胞不消亡，这种Brdu就在胞核的DNA中长期存留。掺入到DNA的Brdu可通过抗Brdu单克隆抗体在组织切片或细胞爬片上显示。该方法能对细胞周期进行迅速而稳定的测量，而且标记Brdu的细胞只要不受到紫外线照射，就对细胞本身没有功能损害。该技术可应用到跟踪检测移植细胞的存活、分化和功能状态。

大鼠骨髓间充质干细胞移植到大鼠心肌后会凋亡或死亡^[15]，究其原因包括移植区域的免疫炎性反应，移植细胞的成活率、活力及纯度等。为了作相关的探索，本研究采用近交系SD雄性大鼠(同基因遗传背景)为研究对象，尽量减少免疫排斥反应，并选择成活率达100%、活力达99%、纯度达90%的骨髓间充质干细胞作为研究对象，尽量提高细胞移植后的成活率。本研究采用文献报道的9×10⁶-28×10⁶个为最佳移植剂量的浓度移植^[16]，避免过低剂量而使得移植细胞稀少，过高而使得移植细胞过于密集。

本研究采取Ali等^[10]公认的方法制作大鼠心肌梗死模型，其造模成功率高，模型成活率高、成活状况良好，使得移植后干细胞无心肌梗死外其他病理因素影响其凋亡。本研究将骨髓间充质干细胞移植于心肌梗死周边区，该区域有相对正常的心肌血液供应，能满足移植细胞各种营养物质需求，保证其正常生长，该区域为心肌梗死后病理生理最活跃的区域，心肌梗死后瘢痕修复最开始的区域。

骨髓间充质干细胞移植梗死后心肌能够改善预后^[1-7]，研究其机制也成为近年的研究热点。但骨髓间充质干细胞移植后对心功能改善的影响需数周甚至数月后才能体现，而其对心脏微环境的影响在何时产生，目前研究甚少。移植后骨髓间充质干细胞存活状况及发挥作用的最佳时期是本研究的切入点。大部分研究证实骨髓间充质干细胞移植心肌后不会转化为心肌组织^[17]，而是通过其对微环境的影响而发挥作用。

本研究发现经Brdu标记的大鼠骨髓间充质干细胞移植梗死后大鼠心肌后，心肌组织中Brdu标记的骨髓间充质干细胞随移植天数逐渐减少，其减少速度在第7-14天最快，而且在第20天时已无Brdu标记的骨髓间充质干细胞能检测出。结果提示骨髓间充质干细胞移植心脏以后会逐渐凋亡，凋亡时期集中于第7-14天，也提示骨髓间充质干细胞发挥作用的最佳时期在1周以内，可能于移植的第1周内通过影响心肌组织内环境而发挥作用。同时，前面提到Brdu标记存在于细胞的DNA中，不会随细胞的转化而消失，只有细胞的凋亡或死亡才会导致其下降^[18-20]，由此可得出结论，骨髓间充质干细胞移植大鼠心肌后不会转化为任何心肌组织。这为进一步研究其机制提供前期依据，可集中于移植后1周内通过对心肌微环境进行研究而了解其作用机制，并可为延长干细胞存活延长其作用时间提供前期研究基础。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
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